摘要:目的 對兔疫透射比濁法測定血清視黃醇結(jié)合蛋自(RBP)進(jìn)行方法學(xué)和臨床應(yīng)用評價。方法 用兔疫透射比濁法測定62例腎病患者(腎小球腎炎35例、糖尿病腎病14例、慢性腎功能衰竭13例)、86例肝病患者(急性肝炎21例、肝硬化49例、肝惡性腫瘤16例)及100名健康體檢者的血清RBP含量，根據(jù)關(guān)國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)相關(guān)文件對其進(jìn)行精密度、線性、準(zhǔn)確度等方法學(xué)評價以及臨床應(yīng)用初探。結(jié)果 兔疫透射比濁法的批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為2.05%~4.3%，批間CV為2. 94%一5 41%，總C V為2 .7%一8. 85%線性不低于120 m g /I,回歸方程為Y= 0 934X+ 4 .83 ,r=0 975。最低檢測濃度為1 mg/L。低、中、高濃度回收率分別為109.5%、96.2%，98.8%總回收率為99 4%。該法與DADE BEHRNG特種蛋白儀的相關(guān)性良好(r=0 997) 腎病各組的血清RBP含量均高于健康對照組(P均<0 01),但腎病組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)肝病各組的血清RBP含量均低于健康對照組(P均<0.01)。肝病組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論兔疫透射比濁法簡便、快速、靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確，可用全自動生化分析儀測試，宜于推廣。RBP對肝、腎疾病的診斷都有臨床意義。

         關(guān)鍵詞:視黃醇結(jié)合蛋自;兔疫透射比濁法;肝病;腎病

Abstract:Objective  To evaluate c;linical application and methodology of seluln retinol-binding protein(RBP)levels by inmune turbirlimetly Methods A total of 62 patients w ith nephropathy(35 glnnelular nephritis case, 14 diabetlc nephropathy cases and 13 ChlronicIrenal failure cases),   and 100 healthy subjects were enrolled.Serum RBP levels were determined by immune turbidimetru . According to National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS) documents ,the precision ,linearity ,accuracy and clinical application were evaluated. Results The within-run coefficient of variation (cv)was 2.05%-4.35%,and the between-run CV was 2,94%-5.41%.The total   CV was2.71%-8.85%.the linearity was ≥120mg/L ,and the regression equation was Y=0.934X+4.828(r=0.975). The minimum detection level was 1mg/L. The low ,middle and high recoveries were 109.5%,96.2%and 98.8%. The total recovery was 99.4%.The method and the special protein analyzer of DADE BEHRING were correlated well (r=0.997). The serum RBP levels of nephropathy patients were all higher than those of heslthy controls (p＜0.01）.The serum RBP levels had no statistical significance between the 3 kinds of nephropathy patients (p＜0.05）。The serum RBP levels of liver disease patients were all lower than those of healthy controls (p＜0.01）.Conclusins  Immune turbidimetry is simple ,rapid ,sensitve and accurate ,and RBP can be tested by automatic biochemical analyzer .It is suitable for clinical laboratory application. RBP has aclinical significance for liver and kidney disease diagnosis .

 

視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protieon,RBP) 1961年由B ergganl在a2-球蛋白區(qū)域發(fā)現(xiàn)的，稱為長a2-球蛋白〔1〕1968年由kanai等分離提純〔2〕根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能不同分為單純視黃醇結(jié)合蛋白(RBP) ,細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBP) ,細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白(CRABP)及細(xì)胞視黃醛結(jié)合蛋白(CRAIbp)等。RBP由肝細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，90%與視黃醇結(jié)合，稱為holo-RBP,其余的稱為apo-RBP. RBP廣泛分布于人體血清、腦脊液、尿液及其他體液中。在血液中，RBP與視黃醇、前白蛋白以1: 1: 1(mol)的復(fù)合物形式存在，轉(zhuǎn)運體內(nèi)90%的視黃醇至機(jī)體組織。游離的RBP從腎小球濾出，其中絕大部分被近端腎小管上皮細(xì)胞重吸收，并被分解，僅有少量從尿中排出。血、尿中RBP濃度改變能夠敏感地反映近端腎小管功能、肝功能損害程度〔3-6〕。目前測定血、尿中的RBP方法較多，有放射免疫擴(kuò)散、免疫濁〔7〕免疫電泳、酶聯(lián)免疫吸附和放射免疫分析。免疫透射比濁法則因易于自動化分析而擁有更為

廣泛應(yīng)用的應(yīng)用前景。

材料和方法

一、實驗對象

1.對照組 ?？谑腥嗣襻t(yī)院健康體檢者100例，年齡21~78歲，其中男45名，女55名。經(jīng)B超、心電圖和臨床各項檢查無肝病、腎病、冠心病、腫瘤、糖尿病等病史和疾病。

2.病例組  收集?？谑腥嗣襻t(yī)院2009年11月1日至2010年3月31日腎內(nèi)科、消化內(nèi)科、內(nèi)分泌科的住院患者和門診患者。按照第2屆全國腎臟病學(xué)術(shù)會議的腎臟疾病的臨床分類法將腎病組(62例)分為腎小球腎炎35例、糖尿病腎病14例、慢性腎功能衰竭13例。按照肝臟疾病的病變程度將肝病組(86例)分為急性肝炎21例、肝硬化49例、肝惡性腫瘤16例。

二、儀器和試劑

HITACHI  7600全自動生化分析儀，RBP試劑由寧波瑞源生物科技有限公司提供，校準(zhǔn)品由DADE BEHRILVG公司提供(批號:083685A );白蛋白(A Ib)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、x ;}-氨酞基轉(zhuǎn)移酶( GGT )試劑由伊利康生化試劑有限公司提供(批號分別為090812, 090614, 090718, 090815 ) 。DADE BEHR 1LVG特種蛋白儀，RBP原廠配套試劑

批號為DF8106798) ,緩沖液Buf'f-erl (批號為DF501271)、稀釋液Diluentl(批號為DF304162)

及校標(biāo)液CA L 1（批號為DF409437)。

三、方法

1.RBP測定 在HIITACHI 7600全自動生化分析儀上采用免疫透射比濁法(二點終點法)測定。待測血清4uI,加試劑1 ( R 1) 240 uL后，37℃孵育16個循環(huán)，讀測第1點吸光度(A1 )值，加入試劑2( R2) 60 uI, 37℃孵育至31個循環(huán)，讀測第2點A值(A2)}待測血清A =A2一A1待測樣本RBP濃度（mg/L）=[樣本A值（A 2一A1)/校準(zhǔn)品A值（A2-A1）*RBP校準(zhǔn)濃(m g /L)。DADE  BEHRILVG特種蛋白儀RBP項目按說明書操作。

2.其他項目Alb 采用終點法，ALT、ALP、GGT均為酶速率法GGT均為酶速率法。四、四、方法學(xué)評價

1.空白試驗 用生理鹽水作為樣本，按照測定方法重復(fù)測定3次，取平均A值。

2.線性根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS) EP6-P文件，取1份RBP為120 m g /L的標(biāo)準(zhǔn)品做一定倍數(shù)稀釋，分別取20,40,60,80,120 mg/L  5個不同濃度的樣本，連續(xù)測定2次取平均值。

3.精密度根據(jù)(NCCLS )EPS -6文件，取高(68.0 m g /L)、低(30.1 m g /L) 2個濃度的RBP血清樣本，分別測定20次，連續(xù)測定20 d。

4.最低檢測濃度以R1代替R2(抗體)，用新鮮混合血清重復(fù)測定20次，用x±2s計算最低檢測濃度。

5.回收實驗 取一份新鮮血清，分別加入等量42,104,160 mg/L 3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(廠家提供)，做回收實驗。

6參考范圍 選擇正常健康體檢成年人100名、新生兒33名,0~17周歲健康人群115名(按0~1,2~3,4~5、6~7,8~9, 10~11、12~13,14~15,16 ~17年齡段分組)。

7.特異性 驗證RBP抗體與a,-微球蛋白、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白有無交義反應(yīng)。

8干擾試驗 取1份血清RBP為56 mg/L的樣本，加入不同濃度三酞甘油(TG)、總膽紅素( TB i1)和血紅蛋白(H b)，測定有無干擾。

9.比對試驗隨機(jī)取日常檢測的血清樣本30份(包含低、中、高值)，分別用由上海北加RBP試劑盒和H ITACH I 7600全自動生化分析儀組成的檢測系統(tǒng)與DADE BEHRILVG特種蛋白儀RBP檢測項目作比對。計算相關(guān)系數(shù)(r)，進(jìn)行配對t檢驗。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

采用M icrosoft Exce12009和SPSS13 0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用x士s、表示，顯著性檢驗用方差分析。

一、方法學(xué)評價

1.空白試驗空白A值≤0.05。

2線性 線性回歸方程為Y = 0 934 x+4 83，r= 0 975。當(dāng)試劑與樣本比率為75: 1時

線性不低于120 mg/L。

3精密度 低值( 30. 1 mg/L)批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為4.35%、批間CV為5.41%，總CV為8.85%；高值( 68 .0mg/L)批內(nèi)CV為2.05%批間CV為2 94%，總CV為2 71%。

4最低檢測濃度 計算得出免疫透射比濁法測定RBP的最低檢測濃度為1 mg/L。

5回收實驗42,104,160 m g/L  3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的回收率分別為109.5%、96.2%98.8%

總回收率為99. 4%。

6參考范圍 正常成年人無年齡、性別差異，16周歲以上少年RBP水平接近正常成年人。

結(jié)果見表1

 

 

7.特異性 經(jīng)實驗，RBP抗體與a,-微球蛋白、β2-微球蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白無交義反應(yīng)。

8干擾試驗TG<6 4 mmol/L,Hb< 4 0 g/L、TBiI< 160umol/L時對本方法測定RBP無明顯干擾。見表2

 

 

 

9.比對試驗該法與DADE BEHRILNG特種蛋白儀RBP項目比較，回歸方程為Y= 1. 012X -0.038   r= 0 997, t= 1.782，P >,0.05兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

九、臨床應(yīng)用

1.腎病腎小球腎炎、慢性腎功能衰竭和糖尿病腎病患者(排除同時患有肝病的患者)血清RBP水平均高于正常對照組(P <0.01)，而3種腎病組問差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。

見表3

 

 

2肝病急性肝炎、肝硬化、肝惡性腫瘤患者(排除同時患有腎病的患者)血清RBP水平均低于正常對照組(P <0.01，而3種肝病組間血清RBP無差異(P > 0.05)。見表3

3腎病患者血清RBP不升高原因分析 分析54例血清RBP< 76 11 mg/I,而半膚氨酸蛋白酶抑制劑C(Csy C)和其他腎功能指標(biāo)升高的腎炎和腎功能衰竭患者肝功能結(jié)果，有90.74%的患者白蛋白[（27. 67士6 38) g/L]低于正常參考范圍，而A LT等指標(biāo)升高者只占12 9%同時分析同期49例血清RBP< 76 .11 mg/I,而C sy C和其他腎功能指標(biāo)升高的糖尿病腎病患者肝功能結(jié)果，白蛋白[（30.95士4 .44) g/L]降低并不明顯，但有71.4%患者氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶或轉(zhuǎn)膚酶指標(biāo)升高，可見糖尿病腎病患者RBP不升高主要由肝臟功能

異常引起。

見表4

 

目前，測定血清RBP的方法很多，有放射免疫擴(kuò)散、免疫比濁、免疫電泳、酶聯(lián)免疫吸附和放射免疫分析等。免疫透射比濁法操作簡單、儀器設(shè)備要求不高、沒有環(huán)保和操作人員自身防護(hù)等問題，空白試驗、線性、精密度、特異性、最低檢測濃度和回收實驗等都能滿足臨床要求。該法簡便快速、靈敏高、適用于全自動生化分析儀，臨床上易于推廣。

臨床應(yīng)用方面，本研究分別選取了肝功能異常和腎功能異常的患者對其進(jìn)行臨床應(yīng)用的初步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝功能正常的情況下，當(dāng)腎小球率過濾降低時，RBP排泄減少，血清中RBP的蓄積，導(dǎo)致血清RBP含量不同程度的升高。在肝病組，當(dāng)肝功能異常時，產(chǎn)生的RBP的量減少，血清RBP的含量下降，結(jié)果見表3

通過對腎病患者血清RBP不升高原因分析，本研究發(fā)現(xiàn)腎炎和腎功能衰竭患者血清RBP不升高主要是腎小球濾過膜通透性升高引起，說明隨著腎病進(jìn)一步發(fā)展，血清RBP不升反降;而糖尿病腎病患者血清RBP不升高的主要原因是肝臟功能異常。

 由上可知，血清RBP檢測對腎病和肝病都是一個非常好的指標(biāo)，相對于尿酸、尿素、肌配、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、白蛋白等單項指標(biāo)來說，其升高和減低都具有臨床意義，但在腎病發(fā)展過程中血清RBP在不同

階段有不同的變化〔7〕，同時還會受肝功能的影響，這一點在分析時必須引起足夠的注意。免疫透射比濁法測定血清RBP是一種較為靈敏和特異的指標(biāo)，操作方便，適用于各類自動化生化分析儀。如將血清RBP的檢測與其他指標(biāo)聯(lián)合測定，相信對于疾病的臨床診斷將更為有效。

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